Introducción. Las bacterias son microorganismos unicelulares causantes de múltiples enfermedades. En la actualidad constituyen un problema de salud pública debido a su alta tasa de resistencia a los antimicrobianos por diferentes mecanismos. Staphylococcus aureus es una de las especies predominantes en los seres humanos, asociada a factores de virulencia y dentro de estos, destacan enterotoxinas A, B, C, D, E, siendo causantes de Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETAs). Objetivo. Determinar la susceptibilidad antimicrobiana y enterotoxinas en Staphylococcus aureus aislado de queso fresco expendido en mercados municipales de la ciudad de Cuenca – Ecuador. Metodología. La presente investigación se trata de un estudio de tipo descriptivo, de corte transversal, mediante la aplicación de métodos fenotípicos y moleculares para la determinación de la susceptibilidad de antimicrobianos, e identificación de enterotoxinas. Resultados. Mediante técnicas microbiológicas y biología molecular se confirmó, por medio de los genes nucA, femB la presencia de 3 muestras positivas para S. aureus, por otro lado, en la prueba de susceptibilidad obtuvimos un alto porcentaje de resistencia a penicilina de todas las muestras, sin embargo, para clindamicina, eritromicina y cefoxitina resultó completamente sensible, por lo que mediante la amplificación del gen blaZ se confirmó la resistencia a penicilina. Por otra parte, no se encontró la presencia de enterotoxinas, mediante métodos moleculares. Conclusión. El 62,5% de las muestras positivas resultaron resistentes a penicilina, confirmado mediante la amplificación del gen blaZ. En contra parte, el 100% resultó sensible para clindamicina, eritromicina y cefoxitina. Área de estudio general: Bioquímica y Farmacia. Área de estudio específica: Microbiología de alimentos y Biología molecular. Tipo de estudio: Original.