Investigación científica forense mediante técni= cas de coloración en casos de delito sexual

Forensic scientific research using coloration techniques in cases of sexual offense

Joseline Lizbeth Frías García^{^[1]}, Verónica Paulina Cáceres Manzano^{^[2]}, Adriana Monserrath Monge Moreno^{^[3]}& Patricia Jenny Lescano Fonseca^{^[4]}

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Recibido: 10-02-2019 / Revisado: 15-02-209 /Aceptado: 04-03-2019/ Publicado: 14-06-20= 19

Abstract. DOI: https://doi.org/10.33262/c= ienciadigital.v3i1.1.361

Within the Forensic Area, the spermatozoon tracking contributes to the investigation o= f a Sexual Offense constituting as a complementary / confirmatory test in case = of positive findings, which later appear as evidence before a trial, through expert reports. In our investigation, we wanted to try an alternative stain= ing technique that contributes to the Forensic stains thus contributing to the Investigative Sciences in cases of Crime or a sexual assault allowing the proper investigation of the act in search of its authors. For this reason, = when comparing the Eosin and Christmas Tree technique in the spermatozoid tracin= g, and applying the protocols known for them, we find advantages and disadvant= ages in microscopic observation that directly affect the quality of visualization and differentiation of the Parts of sperm cells, but with great success for= the positive finding in the determination of the presence or absence of spermat= ozoa in the samples analyzed.

Keywords: Forensic, staining, screening, spermatozoon

Resumen.

Dentro del Área Forense el rastreo de espermatozoides contribuye a la investigación de un Delito Sexual constituyéndose como una prueba complementaria / confirmatoria en caso de hallazgos positivos, que posterior se presentan como evidencia ante un juic= io, mediante informes periciales. En nuestra investigación quisimos probar una técnica de tinción alternativa, que contribuya a las tinciones Forenses aportando de esta manera a las Cie= ncias Investigativas en casos de Delito o una agresión sexual permitiendo la investigación adecuada del acto en busca de sus autores. Es por ello que al comparar la técnica de Eosina y Christmas Tree en el rastreo de espermatozoides, y aplicando los protocolos conocidos para las mismas, hallamos ventajas y desventajas en la observación microscópica que afectan de forma directa a la calid= ad de visualización y diferenciación de las partes de las células espermáticas, pero con gran éxito para el hallazgo po= sitivo en la determinación de presencia o ausencia de espermatozoides en las muest= ras analizadas. =

Pal= abras claves: Forense, tinción, rastreo, espermatozoide.

= Introducción.

Se define a= las ciencias forenses como el conjunto de varias ciencias, técnicas y métodos q= ue se aplican con el fin de buscar la verdad y a los autores de un delito, mediante el análisis de indicios, manejados en el marco legal. Hoy en día gracias a los esfuerzo por garantizar una justicia transparente, el Ecuador cuenta con una red de 8 Ce= ntro de Investigación de Ciencias Forenses (CICF) que cuentan con diversas áreas para el proceso pericial en los diferentes delitos a tratar, así como el área de Biología Forense. (Fiscalí= a, 2013)

La Biología forense es la rama de las ciencias forenses encargada del análisis científi= co de indicios biológicos, de una escena del crimen sean esta de homicidio, femicidio, delito sexual u otros. Un Delito Sexual es un problema social qu= e no solo afecta a la víctima como tal, afecta a sus familiares, amigos; y el ta= bú moralista en nuestro país aún existe por lo que tratando de minimizar las c= osas acuden a otros lugares, que a las entidades correspondientes, y por los distintos campos que abarca cada área los procedimiento en un caso de delito sexual no podrían ser aplicados de forma correcta como para una investigaci= ón judicial (López H., 2010).Es por ello que la intención de la presente investigación es probar una alternativa que pueda ser utilizada en distintos sitios ya que al ser contrastada con un estándar como es la Técni= ca de Árbol de Navidad o Christmas Tree constituya parte del primer indicio en= la corroboración de un delito sexual siendo una evidencia confiable y muy poco cuestionable al ser presentada ante un juicio.

El estudio = del Líquido espermático es de vital importancia y dentro de este se encuentra el rastreo de espermatozoides, lo cual se realiza mediante tinciones que permi= ten el contraste al momento de su visualización al microscopio , la Técnica de Christmas Tree o Árbol de Navidad para el rastreo de espermatozoides, fue v= isto por primera vez al microscopio por Van Leeuwenhoek en el ańo 1678, quien observo espermatozoides células que se encuentra exclusivamente en el tracto genital masculino y cuya finalidad es la reproducción. La anatomía del espermatozoide consta d= e una cabeza, un cuello y una cola que es más larga con relación a al tamańo de la cabeza. Esta tinción es específica para espermatozoides, el material nuclea= r se tińe de color rojo o rojo/púrpura, el cuerpo de los espermatozoides se obse= rva de forma ovalada y teńido de rojo con un fondo rosado ligero, el acrosoma d= el espermatozoide se tińe de color rojo ligero, la región media y la cola de l= os espermatozoides se tińen de color verde o azul verdoso. (Atieza I. y Martín= ez P. 2010)

La técnica = que probaremos será la técnica de Eosina, la cual también conocida como un test= de vitalidad o de Williams Pollack, esta es una tinción supra vital, muy utili= zada en el laboratorio Clínico dentro del espermatograma para determinar espermatozoides vivos y muertos, debido que en los espermatozoides muertos poseen gran permeabilidad de la membrana, permitiendo teńir su estructuras = de un color Rojo / Rosado distinguiéndose cabeza y cola del espermatozoide. (Mellisho E.)

Basándonos = en los principios anteriores y como parte objetiva de nuestra investigación a = más de comparar la visualización al microscopio de las técnicas aplicadas al rastreo de espermatozoides queremos obtener una alternativa confiable de tinción con resultados exitosos, que se pueda aplicar dentro del marco lega= l.

Metodologia.

La investigación es de tipo experimental, comparativa de campo con el que se= pudo establecer conclusiones por método inductivo y deductivo, se trabajó con va= rias muestras en esta investigación transversal, por lo cual trabajamos con toda= la población como muestra; Toda la información en la investigación se obtuvo mediante el análisis documental extraíd= o de una fuente secundaria y la aplicac= ión de las Técnicas de Christmas Tree y Eosina para el rastreo de espermatozoides ejecutando los protocolos y procedimientos ya conocidos en el análisis de l= as diferentes muestras. Usamos los materiales y equipos disponibles en la Universidad Nacional de Chimborazo para el análisis de las muestras, de las cuales se realizó dos placas /frotis de nuestras muestras conocidas para aplicar la tinción de Christmas Tree y la segunda para Eosina, que nos permite documentar mediante fotograf= ías los hallazgos positivos, como se incluyen en los informes periciales. =

Protocolo para la obtención de muestra en Soporte Sólido=

Existen muchos casos en los que los fluidos biológicos como el semen se deben retirar de soportes sólidos como son la r= opa interior de la víctima o del agresor para posterior estudio de espermatozoi= des. Para estos casos, debemos recurrir a un procedimiento llamado levantamiento= de evidencias en donde recuperamos los fluidos biológicos para estudio, para lo cual utilizamos el siguiente procedimiento:

1.&n= bsp; Observar el soporte solido en la luz forense.

2.&n= bsp; Identificar= la zona en donde existe fluorescencia para determinar la ubicación del supuesto fluido biológico.

3.&n= bsp; La extracci= ón de muestras en superficies solidas se tomará con hisopo (corte longitudinal= ) y en los demás casos se realizará un corte aprox. 3mm ó 5mm.

4.&n= bsp; Agregar en = un microtubo con 200ul de buffer de extracción.

5.&n= bsp; Agitar con = un dispositivo Vortex por 30 minutos a mínima rpm.

6.&n= bsp; Centrifugue= la muestra 8 minutos a 3.600 rpm.

7.&n= bsp; Eliminar el sobrenadante con una pipeta.

8.&n= bsp; Transferir = el sedimento a una placa porta objetos.

9.&n= bsp; Fijar la pl= aca.

10. Realizar la tinción “Árbol de Navidad” descrita anteriormente.

Técnica de Christmas Tree

1.&n= bsp; Visualizar = en la placa donde se encuentra el frotis y delimitar el frotis con lápiz demográfico.

2.&n= bsp; Fijar el fr= otis a calor seco o exponerlo a la llama directamente.

3.&n= bsp; Colocar unas cuantas gotas (que cubra el frotis) de la solución Kernechtrot (rojo nuclea= r) y dejar durante 20 min. (Reactivo 1)= .

4.&n= bsp; Lavar con a= gua destilada.

5.&n= bsp; Colocar unas cuantas gotas (que cubra el frotis) de la solución picroíndigocarmine y dej= ar actuar con el tiempo correspondien= te a 15 segundos (Reactivo 2)

6.&n= bsp; Aclarar el frotis con etanol al 95 % lavando la placa.

7.&n= bsp; Dejar secar= y montar la placa con permount.

8.&n= bsp; Observar en lente 40 X

Técnica de Eosina

1.&n= bsp; Visualizar = el frotis

2.&n= bsp; Fijar el fr= otis a calor seco o a la llama directam= ente

3.&n= bsp; Colocar una= s cuantas gotas de Eosina , de manera que cubra todo el frotis

4.&n= bsp; Dejar actua= r 1 minuto

5.&n= bsp; Lavar con a= gua destilada

a. Dejar secar= y montar con Permount <= /o:p>

6.&n= bsp; Observar en lente 40 X = <= /span>

Resultados.

Se analizaron un total de 62 muestras en un per= iodo de 6 meses como se observa en la Tabla 1, y el número de casos atendidos por mes. Con un total de 107 muestras analizadas, obtuvimos 50 resultados posit= ivos para la presencia de espermatozoides, y 57 negativos para el rastreo de espermatozoides presentados en la Tabla 2.

*Muestras Sexuales por Mes*
*Mes =*	Número de Casos	Porcentaj= e
Julio	8	13%
Agosto	11	18%
Septiembre	9	15%
Octubre	12	19%
Noviembre	10	16%

Diciembre	12	19%
*Total*	62	100%

= Tabla 1: Número Ca= sos de Delitos Sexuales dados en el Periodo Julio -Diciembre 2016

Fuente: Datos obtenidos de las muestras Analizadas=

Elaborado por: Joseline Frías

Al observar las placas al microscopio se documentaron los hallazgos positivos fotográficos en los cuales se evidencian las diferencias de la tinción entr= e la Técnica de Eosina con la Técnica de Christmas Tree, la Figura A nos muestra= la tinción de Christmas Tree, en la cual observamos la diferenciación celular esperada y descrita por varios autores ańos atrás en la cual se observara la cabeza, acrosoma de color rojo/ rosado y la cola de color verde, lo que permite el reconocimiento acertado de las células espermáticas y sus estructuras, así es posible reconocer solo cabez= as o solo la cola del espermatozoide, lo cual indicaría la presencia de los mism= os reportándose como positivo para cabezas o colas, esta técnica aplicada al rastreo de espermatozoides en caso de delitos sexuales, usada y estandarizada dentro del marco judicial en varios países, como en Colombia –Bogotá en el centro de Biología Forense de la Dirección Regional = de Bogotá tras trabajar con gran cantidad de casos adjudican la efectividad de visualización de esta técnica calificándola como un éxito en el rastreo de espermatozoides, a la propiedad química de sus colorantes , en esto coincid= en los peritos Martínez y Vallejo que de igual manera describen la calidad de visualización de la Tinción de Christmas Tree en el rastreo de espermatozoi= des. Para corroborar lo dicho, present= amos las figuras: 1A) Observamos Hisopado Vaginal, donde se aprecia al espermatozoide con la tinción de Christmas Tree, Cabeza color Rojo, Acrosoma Rosado, cola verde; cerca de una célula epitelial. 1B) Es una muestra recuperada de un sop= orte sólido, Hisopado de Interior zona Mariposa, donde observamos gran cantidad = de espermatozoides concentrado donde se aprecia la tinción y su especificidad.

*Número de Análisis Realizados*
*Resultado de Análisis*	Cantidad =	Porcentaj= e
Positivo =	50	47%
Negativo =	57	53%<= /o:p>
*Total*	107	100%

Tabla 2: Número de Análisis Positivos (Presencia) y Negativos (Ausencia) para Espermatozoides dados en el Periodo Julio -Diciem= bre 2016

Fuente: = Datos obtenidos de las muestras Analizadas

Elaborado por: Joseline Frías

En la Figura 2 observamos la tinción con Eosina= , una tinción no antes probada en el rastreo de espermatozoides , aunque exis= ten descripciones de rastreos hechos con otras técnicas de tinción diferentes a= la de Christmas Tree como la de Eosina/ Nigrosina, Papa Nicolau, Azul de Metil= eno , pero ninguna de estas echa como un estudio específico del rastreo y mucho menos comparada al estándar que se maneja dentro de la investigación de un delito sexual , es por ello que hasta ahora no se recomienda ninguna de est= as en el rastreo de Espermatozoides.

La Técnica de Eosina presenta una coloración Ro= jo /rosada de la célula espermática, obteniendo una excelente infiltración del colorante en la estructura celular, dando muy buen contraste para el reconocimiento de forma en el rastreo, diferenciando la cabeza de la cola, = la cabeza de rosado y la cola de rojo, permitiendo una buena visualización, garantizando confiabilidad en el rastreo para la validación de resultados; presentamos la Figura 2A) Hisopado Vaginal , donde se observa al espermatoz= oide con la tinción de Eosina, se diferencia de forma clara la Cabeza de la cola= y una célula epitelial. 2B) Muestra de recuperada de un soporte sólido, inter= ior zona mariposa, observamos la concentración de espermatozoides donde observa= mos la tinción en las células espermáticas.

Figura N° 1: Tinción de Christmas Tree

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Fig. 1A) Hisopado Vaginal Fig. 1B) Hisopado Interior zona Mariposa

Fuente: Laboratorio de la UNACH Fuente: Laboratorio de la UNACH

Figura = N° 2: Tinción con Eosina

Fig. 2A) Hisopado Vaginal Fig. 1B) Hisopado Interior zona Mariposa

Fuente: Laboratorio de la UNACH Fuente: Laboratorio de la UNACH

Al comparar las dos tinciones observadas hallam= os la mayor diferencia de estas, que radica en la especificidad del contraste dado por los colorantes, en la técnic= a de Christmas Tree como describimos en la observación, existe especificidad en = las estructuras espermáticas celulares, mientras que en la técnica de Eosina es= ta cualidad está ausente , esto se debe en primera a la variedad de colorantes usados en cada técnica que interfiere de manera directa en la complejidad y costos de las mismas, pero que en calidad de visualización para identificar= a espermatozoides no interfiere de forma radical siendo la técnica de Eosina = una alternativa exitosa en el rastreo de espermatozoides , aplicada en casos de delito sexual lo cual podría permitirse como evidencia en un juicio.

= Conclusiones

· &nb= sp; Probamos una nueva alternativa para el rastreo de espermatozoides, en los casos de delit= os sexuales, con una técnica más sencilla, fácil de aplicar y más accesible pa= ra las casas de salud

· &nb= sp; Al analizar= el resultado obtenidos del rastreo de espermatozoides realizados mediante la técnica de Christmas Tree y Eosina obtuvimos datos relevantes con respecto = a la efectividad de la observación de cada una de las técnicas.

· &nb= sp; Establecimos las ventajas y desventajas en el uso de ambas técnicas tanto de Christmas T= ree como de la Eosina en el rastreo de espermatozoides.

Referencias bibliográficas

Atienza I, Martínez P. Identificación de vestig= ios de semen. Delgado Bueno S, director. Patología y Biología Forense. Tratado de Medicina Legal y<= span style=3D'mso-spacerun:yes'> Ciencias.

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Noviembre del 2016]. Disponible en http://www.e= cuadorinmediato.com/index.php?module=3DNoticias&func =3Dnews_user_view&id=3D2818776472

López H. Biología Forense en la Escena del Crimen.[SlideShare].Julio 2010;[05 de Diciembre del 2016]. Disponible en : http://es.slideshare.net/josacama biologia-forense-4664088

Mellisho E. Manual de Laboratorio de Reproducción.2010;[08 de Diciembre del 2016]. Disponible en: http://tarwi.lamolina.edu.pe/~emellisho/ Reproduccion_archivos/= Practica%204-eval-semen.pdf