Diseño
de un sistema bacteriano para la producción y purificación de la proteína
recombinante NcGRA7 utilizando la actividad de Sortasa A de Staphylococcus
aureus
Design of a bacterial system for the production an=
d purification
of recombinant NcGRA7 protein using Staphylococcus aureus Sortase A Activit=
y
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1 |
Janneth Fernanda
Cárdenas Cordero |
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https:=
//orcid.org/0000-0002-7877-4001 |
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Universidad de Cue=
nca
(UCUENCA), Cuenca, Ecuador. Maestría en
Biociencias |
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2 |
Antonio Javier Vallecillo Maza |
|
https:=
//orcid.org/0000-0001-9141-0176 |
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Universidad de Cue=
nca
(UCUENCA), Cuenca, Ecuador. |
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Artículo de Investigación Científica y
Tecnológica Enviado: 15/11/2025 Revisado: 18/12/2025 Aceptado: 30/01/2026 Publicado: 12/02/2026 DOI:https://=
doi.org/10.33262/anatomiadigital.v9i1.2.3605
=
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Cítese: |
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Cárdenas Cordero, J. F., & Vallecillo Maza, A. J. (2026). Diseño =
de
un sistema bacteriano para la producción y purificación de la proteína
recombinante NcGRA7 utilizando la actividad de Sorta=
sa
A de Staphylococcus aure=
us.
Anatomía Digital, 9(1.2), 66-82. https://doi=
.org/10.33262/anatomiadigital.v9i1.2.3605
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Esta revista está protegida bajo una licencia Creative Commons Atribución-NoComercial=
-CompartirIgual 4.0 International. Copia de la licen=
cia: https://creativecommons.org/licens=
es/by-nc-sa/4.0/deed.es |
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Palabras claves:=
Sortasa A. proteínas recombinantes, purificación proteica, NcGRA7,
cromatografía de afinidad a metales. |
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Resumen Introducción. La =
sortasa A (SrtA) es una=
enzima
con actividad endopeptidasa y transpeptidasa presente principalmente en
bacterias Gram positivas. Su capacidad para reconocer secuencias peptídic=
as
específicas permitió su aplicación en el desarrollo de sistemas
biotecnológicos para la producción y purificación de proteínas recombinan=
tes.
El uso de sistemas basados en SrtA optimiza el
procesamiento proteico, facilita la clarificación de las muestras y permi=
te
obtener proteínas con altos niveles de pureza mediante procedimientos
relativamente simples y reproducibles. Objetivo. Desarrollar un
sistema bacteriano de producción y purificación de proteínas recombinantes
basado en la actividad enzimática de la Sortasa A
de Staphylococcus aureus
(Sa-SrtA). Procedimiento. Se modificó =
el
vector de expresión pET15b NT-Histidina (Novagen)
mediante la incorporación de la secuencia codificante de Δ60Sa-SrtA =
(GenBank Ac. No.: AF162687), seguida del motivo cons=
enso
LPET4G, reconocido por la enzima para realizar la escisión proteolítica.
Posteriormente, se clonó la secuencia de la proteína antigénica NcGRA7 de=
Neospora caninum
(GenBank Ac. No.: U82229), generando la
construcción His-tag–Δ60Sa-SrtA–LPET4G–N=
cGRA7.
La expresión del sistema se realizó en Escherichi=
a
coli Rosetta 2 (DE3), y la purificación se
llevó a cabo mediante cromatografía de afinidad a metales inmovilizados
(IMAC) utilizando resina Ni-NTA. La escisión enzimática se indujo en
presencia de Ca²⁺ y triglicina, permiti=
endo
la liberación de la proteína diana. Resultados. El sistema permiti=
ó la
expresión y purificación eficiente de la proteína recombinante NcGRA7,
obteniéndose la proteína mediante un único proceso cromatográfico mediado=
por
la actividad de Δ60Sa-SrtA. Conclusión. El sistema basado en
Δ60Sa-SrtA constituye una herramienta eficaz y reproducible para la
producción y purificación de proteínas recombinantes, con potencial
aplicación en el desarrollo de sistemas diagnósticos y otras aplicaciones
biotecnológicas. Área de estudio general: <=
span
lang=3DES-EC style=3D'font-size:12.0pt;line-height:115%;font-family:"Time=
s New Roman",serif;
mso-fareast-font-family:Calibri;mso-fareast-language:ES-EC'>Biología. =
Área
de estudio específica: Biología molecular. Tipo de estudio: Artículos originales. |
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Keywords: Sortase A, recombinant proteins, protein purification, NcGRA7, immobilized
metal affinity chromatography. |
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Abstract Introduction. =
Sortase=
A (SrtA) is a cysteine transpeptidase=
found
in Gram-positive bacteria, where it catalyzes site-specific peptide bond
cleavage and ligation. Due to these properties, SrtA=
widely applied as a biotechnological tool for the production and purifica=
tion
of recombinant proteins, allowing controlled proteolytic processing and
improved purification efficiency. Objective. This study aimed to
develop a bacterial system for the production and purification of recombi=
nant
proteins based on the enzymatic activity of Staphylococcus aureus Sortase A (Sa-SrtA). |
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1. Introducción
Las
proteínas son moléculas de gran complejidad y diversidad, por ello son
adecuadas para diferentes aplicaciones
En 2004 se desarrolló una herramienta biotecnológi=
ca
basada en la Sa-SrtA que permit=
e la
generación de un sistema de purificación de proteínas recombinantes
Las sortasas se convirtieron en valiosas herramien=
tas
bioquímicas para la purificación de proteínas recombinantes y la ligación
covalente de biomoléculas mediante enlaces peptídicos específicos
La
purificación de proteínas mediante sistemas basados en la actividad enzimát=
ica
de Sa-SrtA requiere una construcción genética específica, con las siguientes
características:
=
d) Región
4: Proteína diana, secuencia correspondiente a la proteína de interés
El sistema de purificación mediado por la actividad
enzimática de Sa-SrtA se fundamenta en la cromatografía de Afinidad a
Metales Inmovilizados (IMAC), la cual aprovecha la actividad endopeptid=
asa
de la enzima para liberar la proteína de interés de la matriz cromatográfic=
a
En este proyecto se obtuvo la proteína Δ60Sa-=
SrtA
enzimáticamente funcional en el modelo de expresión bacteriano E. coli BL21, y logramos la constr=
ucción
genética para la purificación de la proteína 4G-NcGRA7 de Neospora caninum
Los objetivos generales del prese=
nte
estudio fueron:
·&nb=
sp;
Diseñar, construir y
producir un modelo bacteriano para la generación proteínas recombinantes
purificadas mediante la actividad enzimática de la proteína Δ60Sa-SrtA=
.
Y se establecieron como objetivos
específicos:
·&nb=
sp;
Diseñar, construir y
evaluar la funcionalidad un vector de expresión para producción de proteínas
recombinantes fusionadas a la proteína Δ60Sa-SrtA, y la purificación d=
e estas
mediante afinidad a metales y la eliminación del péptido de afinidad con la
actividad de endopeptidasa de la proteína Δ60Sa-SrtA.
· =
Diseñar, construir y
producir dos proteínas antigénicas 4G-NcGRA7 y 4G-NcSAG4 de Neospora caninum purificadas media=
nte
afinidad a metales y la actividad de endopeptidasa de la proteína
Δ60Sa-SrtA.
2.
Metodología
El presente trabajo corresponde a una investigació=
n de
tipo experimental, desarrollada bajo un diseño de laboratorio controlado, e=
n el
que se manipularon de manera intencionada variables biológicas y técnicas p=
ara
evaluar la amplificación, clonación, expresión y purificación de las proteí=
nas
recombinantes His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET4G y 4G-NcGRA7 mediante el uso de
sistemas bacterianos de expresión y cromatografía de afinidad a metales. El
estudio se enmarca en un nivel explicativo, dado que busca comprobar relaci=
ones
causales entre las condiciones experimentales aplicadas y la eficiencia de
obtención de las proteínas de interés. La modalidad de investigación es
cuantitativa, aplicada y de laboratorio, que empleo procedimientos
experimentales reproducibles y controlados con fines de validación
biotecnológica y optimización de técnicas de purificación proteica, utiliza=
ndo
herramientas moleculares y bioquímicas para la obtención y análisis de resu=
ltados
verificables.
Se inició la generación de las construcciones géni=
cas
mediante la amplificación de las regiones Δ60Sa-SrtA y NcGra7 utilizan=
do
los primers correspondientes, establecidos en la sección Anexo 1. Su detecc=
ión
y aislamiento se realizó una electroforesis en gel al 1.2 % de agarosa, teñ=
ido
con Bromuro de etidio (0.3 mg/mL).
El amplicón Δ60Sa-SrtA y el plásmido pET15b se
digirieron secuencialmente con las enzimas de restricción NdeI y BamHI dura=
nte
2 h a 37 °C, seguido de su aislamiento y purificación. Posteriormente se
realizó una PCR de extensión para añadir los residuos complementarios y obt=
ener
el plásmido pET15b con extremos cohesivos. El producto de digestión de Sa-S=
rtA
se ligó al plásmido pET15b con la enzima ADN ligasa T4 y se obtuvo plásmido
pET15-SrtA El
amplicón NcGRA7 se ligó al plásmido pCR2.1 mediante la enzima ADN ligasa T4
para su propagación, obteniéndose el plásmido pCR2.1-NcGRA7.
Para formar el plásmido pET-S4G se intercaló los
primers SRTA-R2 del amplicón Sa-SrtA2 y SRTA-F2 para formar la secuencia
La secuencia codificante del plásmido pCR2.1- NcgR=
A7
fue aislada y se digirió con las enzimas MseI y BamHI. El plásmido pET-S4G =
se
digirió con las enzimas NdeI y BamHI. Finalmente, el inserto con la secuenc=
ia
codificante de NcGRA7 se ligó por separado con la enzima ligasa T4 al plásm=
ido
pET-S4G durante 24h a 16°C para generar el plásmido pET-S4G-NcGRA7.
Los plásmidos obtenidos se clonaron por transforma=
ción
química en la cepa E. coli Top10. A partir
del cultivo bacteriano se aisló el plásmido pET15-SrtA. El plásmido se digi=
rió
con la enzima HindIII y se realizó una electroforesis de ADN con agarosa al
1,2%. Las bandas obtenidas en el gel de agarosa se compararon con las bandas
obtenidas en el programa Serial Cloner para verificar el patrón obtenido.
Los plásmidos pET15-S=
rtA,
pET-S4G, pET-S4G- NcGRA7 aislados y verificados se introdujeron por
transformación química en E. coli <=
/i>Rosetta
2 (DE3). <=
span
style=3D'mso-bookmark:_Toc75792656'>La
expresión de las proteínas se indujo mediante la adición de IPTG (100 µM),<=
/span> inductor de la expre=
sión
de proteínas. Las proteínas se aislaron mediante la lisis de la pared
bacteriana por sonicación y posteriormente se desnaturalizaron por acción
térmica. Las proteínas aisladas fueron His-tag-Δ60Sa-SrtA,
His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET4G, His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET4G-NcGRA7. La presencia de las proteínas se verificó
mediante SDS-PAGE, utilizando un gel concentrador al 3 % y un gel separador=
al
12 %. Las proteínas se visualizaron mediante tinción del gel con Azul Brill=
ante
Coomassie G-250.
La resina Ni-NTA se colocó en la columna
cromatográfica. Se hidrató la resina con 2 volúmenes de agua para
cromatografía. Se equilibró la resina con 2 volúmenes el buffer de Lisis y =
se
repitió 2 veces.
Se colocó 2-4 volúmenes del extracto de la proteína
His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET4G. Se recogió el líquido que no se adhirió a la
resina y este fue la Muestra 1 (M1). Se añadió 5 volúmenes del Buffe=
r de
lavado, se repitió 5 veces y se recogió cada fracción de lavado obteniendo 5
muestras: Muestras 2-6 (M2-M6). Se añadió en la columna, 1 volumen de la
solución de elución se repitió 3 veces y se recogió en una misma fracción y
está fue la muestra 7 (M7). Esta
muestra fue la proteína His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET4G purificada.
Finalmente se añadió 5 volúmenes de agua de
cromatografía y esta fue la muestra 8 (M8). A las 8 muestras se les añadió =
el
buffer de carga para proteínas 2X y las muestras obtenidas fueron
desnaturalizadas mediante ebullición durante 5 minutos. Se realizó un SDS P=
AGE
con un gel concentrador al 3% (voltaje de 60 voltios) y un gel separador del
12% (voltaje de 120 voltios). Las proteínas se visualizaron mediante tinción
del gel con Azul Brillante Coomassie G-250.
Se colocó la resina HPur Ni-NTA en la columna
Ni–NTA. Se hidrató la resina con 2
volúmenes de agua para cromatografía. Se equilibró la resina con 2 volúmene=
s el
buffer de Lisis y se repitió 2 veces.
Se colocó 2-4 volúmenes de los extractos de las
proteínas His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET4G-NcGRA7. Se recogió el líquido que =
no
se adhirió a la resina y esta fue Muestra 1 (M1). Se añadió 5 volúmenes del
Buffer de lavado y se repitió 4 veces y se recogió cada fracción de lavado =
y se
obtuvo 4 muestras: Muestra 2-5 (M2-M5). Se añadió 1 volumen del buffer de
escisión y se esperó 24h para recoger la muestra 6 (M6). Esta muestra conti=
ene
la proteína purificada: 4G-NcGRRA7. La M7 es un lavado previo a la elución =
de
His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET.
Se añadió en la columna, 1 volumen del buffer de
elución, repetimos 3 veces y se recogieron en una misma fracción la muestra=
8
(M8). Esta muestra libera la proteína His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET.
Finalmente, se añadió 5 volúmenes de agua de
cromatografía para obtener la muestra 9 (M9). A las 9 muestras se añadió el
buffer de carga para proteínas 2X y fueron desnaturalizadas mediante ebulli=
ción
durante 5 minutos. Se realizó un SDS PAGE con un gel concentrador al 3% (co=
n un
voltaje de 60 voltios) y un gel separador del 12% (con un voltaje de 120
voltios). Las proteínas se visualizaron mediante tinción del gel con Azul
Brillante Coomassie G-250.
3.
Resultados
Se construyó un prototip=
o de
plásmido pET-S4G-NcGRA7 a partir del vector pET15b como sistema de expresión
bacteriano con control de purificación por afinidad para la proteína de fus=
ión.
El diseño de las proteínas de fusión conllevaba un riesgo potencial =
para
la estabilidad de la fusión. Sin embargo, debido a que la actividad de esci=
sión
de Δ60Sa-SrtA es inducible y moderada, se asumió que la fusión sería
estable durante la expresión de la proteína
La construcción de los
plásmidos pET15-SrtA y pET-S4G fue validada en un sistema bacteriano=
utilizando un mapa de restricción. En la Figura 1a se visualizaron los
plásmidos pET15b (Carril1), pET15-SrtA (Carril 2 y 3) escindidos con la enz=
ima
HindIII generando las bandas de PM de 5559 pb para el vector pET15b y las
bandas de PM de 5559 y 609 pb para el plásmido pET15-SrtA, la banda de PM de
5559 bp representó el vector vacío y la banda de PM de 609 pb presentó la
secuencia codificante para la Δ60Sa-SrtA. También el plásmido pET-S4G
(Carril 4 y 5) fue escindido con la enzima HindIII generando las bandas de =
PM
de 5559, 316 y 326 pb. La banda de PM de 5559 pb fue el vector vacío y las
bandas de PM de 316 y 326 pb que se observaron solapadas en la Figura 1a c=
orresponde
a un corte distinto que realizó la enzima HindIII al plásmido pET-S4G; esto=
se
debió a la presencia del motivo consenso LPET4G que generó un patrón de cor=
te
distinto respecto al plásmido pET15-SrtA. Las bandas obtenidas de las
digestiones de los plásmidos pET15b, pET15-SrtA, pET-S4G fueron semejantes a
las bandas obtenidas por simulación en los mapas de restricción del programa
Serial Cloner al estudiar los 3 plásmidos con la enzima HindIII. El mapa de
restricción verificó la validez de la ligación del plásmido pET15b y la
secuencia codificante de la Δ60Sa-SrtA para generar el plásmido
pET15-SrtA. También este mapeo validó el PCR de extensión superpuesta que
permitió el solapamiento del plásmido pET15-SrtA y el motivo consenso LPET4G
para generar el plásmido pET-S4G, obteniéndose las construcciones pET15-Srt=
A y
pET-S4G.
La construcción del plásmido pET-S4G-NcGRA7 fue validada en un mapa de restricción utilizando la enzima de restricción Hind= III. Se obtuvieron las bandas de PM de 5559, 899 y 316 pb para plásmido pET-S4G-NcGRA7 (Carril 6-9), visualizadas en la Figura 1b. El patrón de bandas obtenidas de las digestiones del plásmido pET-S4G-NcGRA7 fue semejante a las bandas obtenidas por simulación en los mapas de restricción del programa Se= rial Cloner al estudiar el plásmido con la enzima HindIII. La banda de PM de 555= 9 pb caracterizó el vector vacío visualizado también en la Figura 1b. = Las bandas de PM de 5559 y 316 son semejantes en los mapas de restricción lo que nos indica que la banda de PM de 899 pb presenta el segmento de ADN que codificó para la proteína de fusión His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET4G-NcGRA7.<= o:p>
La expresión de las proteínas His-tag-Δ60Sa-S=
rtA
y His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET4G se realizó en cepa de E. coli Rosetta 2(DE3) =
con
la utilización de los plásmidos pET15-SrtA y pET-S4G. La presencia de la
proteína His-tag-Δ60Sa-SrtA se visualizó en el spot de PM de alrededor=
de
25 Kilodaltons (KDa) en el Carril 1(C1) de la Figura 2, verificando la utilidad
del plásmido pET15-SrtA para la expresión de la proteína
His-tag-Δ60Sa-SrtA. La presen=
cia de
la proteína His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET4G se visualizó en el Carril 2 y 3
(C2-C3) de la Figura =
2
por la presencia de 2 spot que nos indicó que la expresión de la
proteína His-tag-Δ60Sa-SrtA -LPET4G generó una proteína lineal con un =
PM
de 25 KDa y una proteína ciclada con un PM de 23 KDa, datos parecidos a los=
que
se presentaron en el estudio de
Figura 2.<=
span
style=3D'mso-bookmark:fig2'> =
SDS-PAGE al 12%. de las proteínas
expresadas His-tag-Δ60Sa-SrtA y His-tag-Δ60Sa-SrtA -LPET4G en su
forma lineal y ciclada en la cepa E. coli Rosetta 2 (DE3).
*C1: Carril 1. Muestra de la proteína
His-tag-Δ60Sa-SrtA. C2.C3: Carril 2-3. Muestra de la proteína
His-tag-Δ60Sa-SrtA -LPET4G. PM. Marcador de peso molecular
La expresión de la proteína de fusión
His-tag-Δ60Sa-SrtA -LPET4G-NcGRA7 se realizó en la cepa de E. coli Rosetta 2 (DE3) utilizando el plásmido pET-S4G-NcGRA7 se visualiza en =
la Figura 3.
Figura 3. =
SDS PAGE al 12%=
de
las proteínas His-tag-Δ60Sa-SrtA -LPET4G y 4G-NcGRA7, 4G-NcSAG4 y
4G-NcGRA7expresadas en la cepa E. coli Rosetta 2 (DE3) *C1-C2: Carril
1-2. Muestra de la proteína de fusión His-tag-Δ60Sa-SrtA -LPET4G-NcSAG=
4.
C3-C4: Carril 3-4. Muestra de la proteína de fusión
His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET4G-NcGRA7. MP: Marcador de peso molecular.
La purificación de la proteína 4G-NcGRA7 se realiz=
ó en
base a la actividad endopeptidasa de la Δ60Sa-SrtA y la IMAC y se
visualizó en la Figura =
4. La M1 fue la fracción que se rec=
ogió
al pasar la muestra del extracto de proteína
His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET4G-NcGRA7 por la columna y que no se fijó en la
Ni-NTA. La proteína de fusión His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET4G-NcGRA7 se fijó=
a
la columna Ni-NTA por las interacciones moleculares
La M8 presentó la proteína His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET, fracción restante de la proteína de fusión His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET4G-NcGRA7 en sus 2 formas: lineal (25KDa) y cic= lada (23 KDa), que se queda unida al Ni-NTA de la columna. La fracción de His-ta= g-Δ60Sa-SrtA-LPET se eluyó por la acción del imidazol del buffer de elución. La M9 fue el lav= ado final de la columna. La presencia de proteína purificada 4G-NcGRA7 visualiz= ada en M7 de la Figura = 4 demostrando la efectividad del si= stema de purificación mediado por Δ60Sa-SrtA para obtener una proteína pura. Demostrando la efectividad del método de mediado por Δ60Sa-SrtA para la purificación de las proteínas recombinantes y la validación de la construcc= ión del vector para la expresión de un sistema de purificación con actividad endopeptidasa para la obtención de proteínas recombinantes puras. La Δ60Sa-SrtA permitió obtener proteínas con una pureza de entre 98-99%.<= o:p>
Figura 4.
SDS-PAGE al 12%.de las diferentes
fracciones de purificación mediante IMAC de la proteína 4G-NcGRA7.*M1: No pegado.
M2-M5: Lavados .M6: Proteína 4G-NcGRA7 purificada. M7: Lavado. M8: La prote=
ína
His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET eluida. M9: Lavado IMAC. MP: marcador de peso
molecular.
4.
Discusión
En este estudio se
logró construir con éxito el plásmido pET-S4G-NcGRA7 a partir del vector pE=
T15b
para la expresión de la proteína de fusión
His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET4G-NcGRA7. La validación mediante mapas de
restricción y simulaciones en Serial Cloner confirmó la correcta inserción =
de
los elementos genéticos involucrados. La expresión de la proteína en E. coli
Rosetta 2(DE3) permitió visualizar tanto formas lineales como cicladas de la
proteína His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET4G, evidenciando la actividad transpep=
tidasa
funcional de Δ60Sa-SrtA. Además, la escisión espontánea observada dura=
nte
la expresión confirmó la actividad endopeptidasa basal de la sortasa, lo cu=
al
representa una ventaja para procesos de purificación automatizada, aunque p=
uede
comprometer la estabilidad de las proteínas de fusión
La proteína objeti=
vo,
4G-NcGRA7, fue obtenida y purificada con éxito utilizando IMAC en conjunto =
con
la actividad de Δ60Sa-SrtA, confirmando la viabilidad del sistema de
escisión para liberar proteínas recombinantes. Aunque la adición de residuo=
s 4G
en el extremo N-terminal representa una posible desventaja para estudios
estructurales, el método demostró ser eficiente para la obtención de proteí=
nas
con alta pureza (98-99%). En conjunto, estos resultados validan la estrateg=
ia
de construcción y purificación basada en sortasa A como una herramienta efi=
caz
para la producción de proteínas recombinantes funcionales.
5.
Conclusiones
· La obtención de la proteí= na recombinante 4G-NcGRA7 de Neospora caninum se logró a partir de la escisión de la proteína de fusión His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET4G-NcGRA7. Es= te proceso fue posible gracias a la actividad endopeptidasa de la Δ60Sa-S= rtA, combinada con la cromatografía de afinidad (IMAC), y fue favorecido por las propiedades fisicoquímicas de la proteína, como su buena solubilidad en el sistema de expresión E. coli Rosetta 2(DE3). La estrategia permitió liberar y purificar de forma eficiente la proteína de interés, sin etiquetas adicionales, mediante un solo paso cromatográfico. La construcción genética= del sistema pET-S4G-NcGRA7 fue validada mediante digestión con enzimas de restricción y análisis por geles, confirmando la correcta inserción de todos los elementos necesarios para la expresión y escisión controlada.
· La presencia de formas ci= cladas y lineales de las proteínas intermedias indicó una actividad basal funciona= l de la Δ60Sa-SrtA durante la expresión, lo que confirma su eficacia, pero también resalta la necesidad de optimización para aplicaciones sensibles. A pesar de la incorporación de residuos 4G en el extremo N-terminal de la proteína escindida, se obtuvo una pureza del 98–99%, lo cual valida esta metodología como una alternativa eficiente para la producción y purificació= n de proteínas recombinantes sin etiquetas.
6.
Conflicto de
intereses
Los autores declaran que no existe conflicto de
intereses en relación con el artículo presentado.
7.
Declaración de
contribución de los autores
Todos autores contribuyeron significativamente en =
la
elaboración del artículo.
8.
Costos de financiamiento
La presente investigación fue financiada por la
Universidad de Cuenca y VLIR-Network Ecuador.
9.
Referencias Bi=
bliográficas
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