Impacto de PH del fijador, tiempo de fijación, tiempo previo sin fijación en la expresividad de marcadores moleculares de inmunohistoquímica

Impact of fixer PH, fixation time, previous time without fixation on the expressivity of molecular markers of immunohistochemistry

Milton David Tapia Medina https://orcid.org/0000-0002-1223= -4176

Médico y cursando la Especialidad en Anatomía Patológica en la Universidad Central= del Ecuador. Quito, Ecuador

mdtapiam@uce.edu.ec <= /span>

	Artículo = de Investigación Científica y Tecnológica Enviado:<= /span> 10/10/2021 Revisado:= 25/10/2021 Aceptado:= 08/11/2021 Publicado= :05/01/2022 DOI: h= ttps://doi.org/10.33262/anatomiadigital.v5i1.1966

Cítese:		Tapia Med= ina, M. D. (2022). Impacto de PH del fijador, tiempo de fijación, tiempo previo sin fijación en la expresividad de marcadores moleculares de inmunohistoquímica. Anatomía Digital, 5(1), 6-25. https://doi.o= rg/10.33262/anatomiadigital.v5i1.1966
	&nbs= p;	ANATOMÍA DIGITAL, es una Revista Electónica, Trimestral, que se publicará en soporte electrónico tiene como misión contribuir a la formación de profesionales competentes con visión humanística y crítica que sean capaces de exponer sus resultados investigativos y científicos en la misma medida que se promueva mediante su intervención cambios positivos en la sociedad. https://anatomiadigital.org La revista es editada por la Editorial Ciencia Digital (Editorial de prestigio registrada en la Cámara Ecuatoriana de Libro con No de Afiliación 663) www.celibro.org.ec<= u>
	&nbs= p;	Esta revi= sta está protegida bajo una licencia Creative Commons AttributionNonCommercialNoDerivatives 4.0 Internati= onal. Copia de la licencia: http://creativecomm= ons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
Palabras claves: fase preanalítica, procesamiento histotecnológico inmunohistoquí= mica, fijación, fijador, pH.		El desarrollo exponencial de la inmunohistoquímica la ha convertido en una pieza fundamental para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de distintas patologías, por esto el conocimiento del procesamiento histotecnológico permitirá la detección oportuna de aquellas variables en las fases del proceso que influyen en la expresión de los inmuno marcadores que generarían errores diagnósticos, pérdida de recursos económicos y biológicos. OBJETI= VO: establecer las condiciones de manejo preanalítico: pH del Fijador, tiempo de fijación, tiempo previo sin fijac= ión, en la expresividad de marcadores de inmunohistoquímica. MÉTODO: se realizó una revisión documental actualizada de publicaciones en la base de datos de revistas indexadas PUBMED y otras con relación al proceso pre analítico, procesami= ento de tejidos en el laboratorio de Anatomía Patológica , técnica de inmunohistoquímica , relación existente entre el resultado de marcadores = de inmunohistoquímica y las variaciones de pH de fijador, tiempos de fijació= n y tiempos previos a fijación, desd= e el ańo 2011, obteniéndose 57 publicaciones , las cuales se consolidaron y se presentaron en este estudio. CONCLUSIÓN: se demuestra la importancia del proceso pre analítico en sus diferentes fases, y su efecto para obtención de laminillas adecuadas para= un correcto análisis. Tiempos de fi= jación y fijadores en pH óptimos son vitales en la fase pre analítica. <= /span>
Keywor= ds: prean= alytical phase, immunohistochemical histotechnology processing, fixation, fixer, p= h.		Abstract The exponential development of immunohistochemistry has become a fundamental piece for the diagnosis, prognosis and treatment of different pathologies, for this rea= son, the knowledge of histotechnology processing will allow the timely detecti= on of those variables in the phases of the process that influence the expres= sion of immunomarkers that would generate diagnostic errors, loss of economic = and biological resources. OBJECTIVE: to establish the preanalytical handling conditions: fixative pH, fixation time, previous time without fixation, in the expression of immunohistochemical markers. METHODS: an updated documentary review of publications in the database of indexed journals PU= BMED and others was carried out in relation to the pre-analytical process, tis= sue processing in the Pathological Anatomy laboratory, immunohistochemical technique, relationship between the result of markers of Immunohistochemi= stry and variations in fixative pH, fixation times and times prior to fixation since 2011, obtaining 57 publications which were consolidated and present= ed in this study. CONCLUSION: the importance of the pre-analytical process in its different phases is demonstrated, and its effect to obtain adequate lamellae for a correct analysis. Optimum fixation and fixation times at pH are vital in the pre-analytical phase. &= nbsp;

Int= roducción

La inmunohistoquímica, es un estudio complementari= o en la rama de la patología que tiene = como objetivo la detección de un antígeno especifico y de su localización en la arquitectura celular, esto se logra a través de una reacción antígeno anticuerpo especifica (Alarcón & Plaza, 2015; Ter & Verani, 2017).

Los inicios de la inmunohistoquímica datan de la década de los 40, no es hasta finales de los 70s cuando existe un crecimien= to exponencial de su uso , a la par del desarrollo de marcadores moleculares <= /span>(Vaquero, 2012; Teruya-Feldstein, 2011; Moorchung & Consultant, 2019), de igual manera la estandarización de normas internacionales que intentan reducir al mínimo factores que alterarían el correcto resultado (Teruya-Feldstein, 2011). En Estados Unidos l= os laboratorios están bajo estricta regulación de la FDA quien verifica el desempeńo, eficacia y precisión de las pruebas diagnósticas y la implementa= ción de protocolos de procesos (Fitzgibbons et al., 2014; Dagher et al., 2019; Maximilian, 2021). En la actualidad los estudios histopatológicos cuyo diagnóstico sea de un tumor maligno o un tumor benigno con sospecha de posible malignidad bajo el criterio del especialista con pruebas de inmuno histoquímica= pueden ser confirmados (Fitzgibbons et al., 2014). Al momento se investigan nuevas sustancias que son producidas por células tumorales y su presencia pueden ser demostradas por pruebas de inmunohistoquímica (Atkins et al., 2004), por lo que esta técnica ha tenido un gran impacto en todas las áreas de la patología, a pesar del auge de otras técnicas como citometría de flujo o té= cnicas moleculares que han aportado grandes contribuciones al área de la patología quirúrgica no han podido desplazar= a la inmunohistoquímica en el uso cotidiano (Miller, 2011; Donovan & Cordon, 2016).

La aplicación   de inmunohistoquímica , es indispensable para el estudio de diferentes tejidos y sus resultados son fundament= ales para el diagnóstico, pronóstico y posterior tratamiento de los pacientes, p= or este motivo es importante antes de emitir un diagnóstico (Parra-Medina & Polo, 2017), demostrar la eficacia y precisión de las pruebas (Hammond et al., 2010). Recientes estudios demuestran que existe variabilidad en la interpretación de resultados entre diferentes laboratorios, producto de fallos en el seguimiento de protocolos preanalíticos y analíticos (Fitzgibbons et al., 2014). Un factor fundamental que induce a resultados erróneos obedecen a fallas   en el proceso pre analítico (Fitzgibbons et al., 2014), tales factores son capaces de introducir artefactos o interferir en un resultado exitoso generando de esta manera pérdida de material, recursos económicos y errores diagnósticos (Vaquero, 2012). El diagnóstico anatomo patológico tiene= como objetivo la categorización de los tumores , especialmente en metástasis en busca del tumor primari= o, así como en tumores indiferenciados (Bellizzi, 2020; Shivani & Lin, 2017). Por lo que las pruebas de inmunohistoquímica son herramientas de gran utili= dad en la práctica diaria para la búsqueda del linaje tumoral , objetivo que con solo la morfología sería imposible alcanzar (Bellizzi, 2020). El impacto de las condiciones del manejo pre analítico es determinante, factores como el pH d= el fijador, el tiempo de fijación y el tiempo previo sin fijación inciden notablemente = sobre la expresividad de los marcadores de inmunohistoquímica.<= /p>
Met= odología

Se realizó una revisión documental actualizada de publicaciones en la base de datos de revistas indexadas PUBMED y otras con relación al proceso pre analítico, procesamiento de tejidos en el laborator= io de Anatomía Patológica , técnica de inmunohistoquímica , relación existente entre el resultado de marcadores de inmunohistoquímica y las variaciones de= pH de fijador, tiempos de fijación y tiempos previos a fijación, desde el ańo 2011, obteniéndose 57 publ= icaciones , las cuales se consolidaron y se presentaron en este estudio.

Resultados

Luego de la búsqueda inicial, se seleccionaron 57 artículos científico que se ajustaban a los criterios de selección, considerando las variables y objetivos del tema de estudio. La figura 1 res= ume el proceso preanalítico con recomendaciones para una adecuada expresividad = de marcadores de inmunohistoquímica en sus distintas fases.<= /p>

Figura 1

Procesamiento preanalítico

Des= arrollo

Concepto de Proceso pre analítico, el desarrollo, perfeccionamiento y estandarización de las técnicas histológicas han supuesto en el mundo de la patología, la piedra angular en el diagnóstico preciso de las distintas entidades nosológicas ,que debido a sus características, algunas de ellas t= an sutiles ,se convierten en verdaderos retos diagnósticos, que sin la ayuda de una laminilla con un adecuado y minucioso proceso pre analítico sería imposible alcanzar (Alarcón & Plaza, 2015).

El preanálisis a pesar de su importancia todavía s= igue siendo un enigma para muchos patólogos, lo que genera dificultades para la identificación de los problemas durante el proceso (Chung et al., 2018).

Se entiende como proceso pre analítico, a la secue= ncia de pasos que inician desde el momento en que el espécimen es extraído hasta= el momento que la laminilla es evaluada por el especialista (Lester, 2014). Durante este lapso tenemos etapas muy bien caracterizadas que va desde la extracción del espéc= imen hasta su procesamiento, este proceso es crucial tanto para una buena evalua= ción en cortes par hematoxilina eosina, como para pruebas complementarias como l= a inmuno histoquímica o el estudio molecular ADDIN CSL_CITAT= ION {"citationItems":[{"id":"ITEM-1","itemDa= ta":{"author":[{"dropping-particle":"",&= quot;family":"Stradleigh","given":"Tyler W","non-dropping-particle":"","parse-names&qu= ot;:false,"suffix":""},{"dropping-particle":&= quot;","family":"Ishida","given":"A= ndrew T","non-dropping-particle":"","parse-names&qu= ot;:false,"suffix":""}],"container-title":&qu= ot;Elsevier","id":"ITEM-1","issue":"= ;1","issued":{"date-parts":[["2015"]]},&= quot;page":"1-22","title":"Progress in Retinal and Eye Research Fixation strategies for retinal immunohistochemistry","type":"article-journal",&qu= ot;volume":"48"},"uris":["http://www.mendeley= .com/documents/?uuid=3D49fae0d0-2077-4a7e-bc17-5d8eb80a81f3"]}],"= mendeley":{"formattedCitation":"(Stradleigh & Ishida, 2015)","plainTextFormattedCitation":"(Stradleigh & Ishida, 2015)","previouslyFormattedCitation":"(19)"},"= ;properties":{"noteIndex":0},"schema":"https:= //github.com/citation-style-language/schema/raw/master/csl-citation.json&qu= ot;}(Stradleigh & Ishida, 2015; Bloom et al., 2019; Biobank, 2018).
Transporte del espécimen= : Del centro quirúrgico al laboratorio de patología, el primer punto crucial en el proceso pre analítico es el transporte de los especímenes, tema poco conocido por parte del cirujano, es de vital importa= ncia la socialización de protocolos de estandarización para un adecuado manejo de las muestras (Gaffney et al., 2018).

Todas las salas de operación deben poseer en sus quirófanos, envases adecuados con formol bufferado al 10%, lo cual va a garantizar la preservación de la muestra y su correcta fijación, dichos envases deben ser de materiales ligeros, de boca grande y = que permitan la inmersión completa del espécimen, caso contrario el proceso de fijación = será heterogéneo (Lester, 2014). <= /p>
El inicio del proceso de autolisis y degeneración = de las proteínas tanto como ADN y ARN comienza inmediatamente tras la extracción de la muestra, lo cual se conoce como tiempo de isquemia, para fines didácticos se la puede clasifica= r en isquemia caliente, definida como el t= iempo en el que el órgano extraído mantiene la temperatura corporal después de la supresión del flujo sanguíneo, dicha fase en varias investigaciones no compromete el estudio posterior (Bass et al, 2014; Bonin & Stanta, 2020; Neumeister & Juhl, 2018). Una segunda fase denominada isquemia fría catalogada como el tiempo entre la extracción de la pieza quirúrgica y su fijación representa un obstáculo para el diagnóst= ico, tanto para el análisis morfológico como para la aplicación de pruebas complementarias como inmunohistoquímica y biología molecular ( Bass et al, 2014; Mathieson et al., 2019) motivo por el cual deben ser sumergidos lo más pronto posible en formol al = 10% bufferado   para detener este proceso.

Lamentablemente no existe un protocolo universal d= e manejo pre analítico de muestras, algunas investigaciones recomiendan, la implementación de instalaciones de laboratorios de patología dentro de los cetros quirúrgicos, lo cual facilitaría el transporte, su valoración macroscópica en fresco y si es necesario toma de tejidos para estudios moleculares (Comanescu et al., 2012; Socias et al., 2019). Uno de los criterios que si se encuentran estandarizados es la sección del = espécimen para una correcta penetración del fijador, cortes cada 3 a 4 mm en muestras mayores de 2 cm, son adecuados para este propósito. (Lester, 2014; Comanescu et al., 2012).

Procesamiento histotecnológico, se denomina procesamiento histotecnológico al conjunto de procesos establecidos que permiten la correcta valoración de los tejidos, manteniendo las facultades naturales del espécimen estudiado (Lester, 2014), este proceso no es rígido y más bien se amolda y modifica de acuerdo a las necesidades de los laboratorio de anatomía patológica= (Megías & Molist, 2016). En líneas generales este proceso se encuentra compuesto por las siguientes etapas: Fijación, Deshidratación, Aclaramiento, Inclusión y Tinción. Cada u= na de ellas tiene un papel fundamental ya que un procesamiento defectuoso en cualquier punto incidirá de manera dramática en el producto final ADDIN CSL_CITAT= ION {"citationItems":[{"id":"ITEM-1","itemDa= ta":{"ISBN":"9789811082511","abstract":&= quot;Fixation is the first step of any histological and cytological laboratory technique.= It is the process by which the cells in the tissue are fixed in a chem- ical a= nd physical state, and all the biochemical and proteolytic activities within t= he cells are prevented so that the cells or tissues can resist any morpho- log= ical change or distortion or decomposition after subsequent treatment with vario= us reagents. The fixation helps to maintain the tissue nearest to its original state in the living system","author":[{"dropping-particle":""= ;,"family":"Dey","given":"Pranab",&= quot;non-dropping-particle":"","parse-names":false= ,"suffix":""}],"edition":"Primera ed","id":"ITEM-1","issued":{"date-p= arts":[["2018"]]},"number-of-pages":"3-27&quo= t;,"publisher":"Springer Heidelberg Dordrecht London New York","publisher-place":"Singapore","title&qu= ot;:"Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology","type":"book"},"uris":["h= ttp://www.mendeley.com/documents/?uuid=3D382c71a8-35cb-4cd8-9ba7-266367081f= a3"]}],"mendeley":{"formattedCitation":"(Dey, 2018)","plainTextFormattedCitation":"(Dey, 2018)","previouslyFormattedCitation":"(30)"},"= ;properties":{"noteIndex":0},"schema":"https:= //github.com/citation-style-language/schema/raw/master/csl-citation.json&qu= ot;}(Dey, 2018) El presente artículo de revisión tiene = como objetivo analizar detalladamente las distintas etapas del procesamiento con énfasis en la fijación de los tejidos.

Fijación, el componente principal de las estructuras de los seres vivos vertebrados son las proteínas y ácidos nucleicos que componen la materia prima de las ma= cro moléculas y tejidos, estas proteínas están conformados por cantidades variables de carbohidratos, que gracias a su conformación molecular hidrofílica captan el agua (Lester, 2014).
Existen distintos fijadores para especímenes biológicos, clasificados por las siguientes características: naturaleza de = la fijación, sus propiedades químicas, componentes que los conforman y su acción sobre l= as pretinas del tejido (Dey, 2018; Anvari & Gharib, 2021).

El principal objetivo de las sustancias de fijació= n es evitar la disolución por el agua y otros líquidos, provocando resistencia a= los tejidos, para impedir su descomposición, gracias a la inactivació= n de enzimas lisosomales y la estabilización de las estructuras dentro de las células y = entre ellas (Lester, 2014), por lo tanto el pro= ceso de fijación permite mantener las características del tejido en estudio lo m= ás cercanas a su estado de un órgano funcionante (Dey, 2018).
Por definición las soluciones de fijación producen= un cambio físico y químico de las estructuras generando alteración de la permeabilidad de la membrana celular a macromoléculas, como la parafina.

En el mercado existe una amplia variedad de fijado= res, unos más populares que otros, cada uno de ellos con ventajas y desventajas.= El fijador ideal para varias guías y est= udios debe ser barato , de fácil uso, qu= e no represente un peligro para la salud del operario , sea rápido y sobre todo = que preserve las características de los tejidos (Dey, 2018).
El proceso de fijación va a generar ciertos cambios específicos en el tejido los cuales son de vital importancia conocer. Uno de ellos es la alteración del volum= en. Algunos fijadores producen edema, otros como el formol o el gl= utaraldehido generan un estado de contracción de volumen del 33% del tejido (Dey, 2018). Bahr y colaboradore= s publicaron en 1955 un estudio en el cual demostraron que la contracción del volumen es inversamente proporcional al grado de concentración de formol (Dey, 2018). Otros fijadores interfieren con la tinción por ejemplo el tetroxido de osmium= que inhibe la captación de hematoxilina y eosina (Lester, 2014; Dey, 2018). Incluso se han reportado cambios morfológicos en la valoración óptica de los tejidos sobre todo en la densidad de los núcleos celulares (Dey, 2018).
Existen ciertos lineamientos establecidos para obt= ener una fijación adecuada. Por ejemplo el volumen necesario de fijador indispensable para lograr una preservación óptima del tejido que debe super= ar de 15 a 20 veces el volumen del tejido (Lester, 2014). Conocer la velocida= d de penetración del fijador es de gran utilidad, esta tiende a ser lenta, 0,1 cm por hora, por lo que el espécimen debe ser seccionado en cortes de 3 a 5 mm de grosor. para lograr una fijación uniforme (Dey, 2018).
Tipos de fijadores, existe una amplia variedad de soluciones fijadoras disponibles en el mercad= o, algunas de ellas con actividad coagulante por ejemplo el sulfato de zinc que facilita la exposición de sitios antigénicos por la formación de macro poro= s, otros sin actividad coagulantes como el formaldehido que tiene la capacidad de modificar los sitios antigénicos por lo que puede suprimir la inmunotinción, se han creado otras sustancias de fija= ción con características coagulantes y no coagulantes (Cards, 2018). La elección del fij= ador debe ser cautelosa porque puede influir en la aplicación posterior de exáme= nes complementarios.

El uso de formaldehido buffer= ado al 10% es recomendada para estudios rutinarios y valoraciones por inmunohis= toquímica (Rourke & Padula, 2016). El uso de fijadores como glutaraldehido o tetroxido de osmium se re= comiendan para tejidos que serán valorados en microscopía electrónica (Dey, 2018).
Por ser el formaldehido el fijador más utilizado en los laboratorios de patología la revisión bibliográfica expondrá sus características más importantes.

Formaldehido, su uso se ha generalizado y estandarizado a nivel mundial para el manejo de las muestras, se comercializa como formaldehido al 40% contiene también metanol= al 10% cuya función es la de retardar la formación de polímeros pesados (Lester, 2014; Donczo & Guttman, 2018).

El formaldehido actúa en distintos puntos de las cadenas proteicas, generando grupos hidroximetil, que desencadena una reacción de enlaces cruzados con formación posterior de pue= ntes de metileno transformando al tejido en insoluble, esta reacción es estable y prolongada (Dey, 2018; Thway et al., 2017).

Ha sido usada por más de 50 ańos, normalmente en concentraciones al 10% bufferado, para mantener= un pH neutro y una presión osmótica similar al medio externo de las células, evit= ando una contracción y endurecimiento excesivos (Lester, 2014; Dey, 2018). Es el fijador de elección en la mayoría de establecimientos médicos para el procesamiento, es económico y la preparación es sencilla (Dey, 2018; Schmeller et al., 2019).

Las   desventajas de este fijador son entre otras su actividad lenta de penetración, de 12= a 24 h para piezas pequeńas, la incapacidad de preservar los mucopolisacaridos ácidos, la generación de artefactos morfológicamente visibles en tejidos altamente vascularizados. ser muy irritante de mucosas y potencialmente car= cinogénico (Dey, 2018; Mastracci et al., 2019; Metovic et al., 2018).

Para poder preservar la ultraestructura de la mues= tra, en varios estudios de investigación recomiendan mantener un rango de pH ent= re 7.2 - 7.4 para evitar el dańo celular (Uguen & Guibourg, 2016).

No hay lineamientos claros en relación con el tiem= po, se recomienda individualizar dependiendo del tejido. Se considera que una ó= ptima fijación requiere un minino de 6 a 8 horas y un máximo de 72 horas, se debe= tener especial cuidado con la sobre fija= ción (Ammerlaan et al., 2018).

Deshidratación, luego de la fijación del tejido se procede a la deshidratación, cuyo objeti= vo fundamental es la eliminación del agua proveniente del espécimen, este proc= eso se realiza mediante el uso de alcoholes u otras sustancias capaces de prese= rvar la estructura celular y no interferir con los pasos siguientes del procesamiento de los tejidos (Dey, 2018; Montuenga & Calvo, 2014).

Comúnmente se utiliza Alcohol etílico en concentraciones ascendentes (50.70,80,95 %), para evitar el dańo, debido a = que cambios bruscos en la deshidratación ocasionan retracción (Lester, 2014). No existen protocol= os estrictos en el número y porcentajes, de alcoholes a utilizar, varias guías dejan estos parámetros al criterio del tecnólogo (Montuenga & Calvo, 2014).

El tiempo que deben permanecer los tejidos en los alcoholes es fundamental, va a depender del volumen de fragmentos que están= en proceso y de su contenido de agua. Debemos recordar que muestras con grosores de entre 2 a 3 mm requieren menos tiemp= o de deshidratación en comparación con tejidos con grosor mayor a 5 mm ADDIN CSL_CITAT= ION {"citationItems":[{"id":"ITEM-1","itemDa= ta":{"ISBN":"9789811082511","abstract":&= quot;Fixation is the first step of any histological and cytological laboratory technique.= It is the process by which the cells in the tissue are fixed in a chem- ical a= nd physical state, and all the biochemical and proteolytic activities within t= he cells are prevented so that the cells or tissues can resist any morpho- log= ical change or distortion or decomposition after subsequent treatment with vario= us reagents. The fixation helps to maintain the tissue nearest to its original state in the living system","author":[{"dropping-particle":""= ;,"family":"Dey","given":"Pranab",&= quot;non-dropping-particle":"","parse-names":false= ,"suffix":""}],"edition":"Primera ed","id":"ITEM-1","issued":{"date-p= arts":[["2018"]]},"number-of-pages":"3-27&quo= t;,"publisher":"Springer Heidelberg Dordrecht London New York","publisher-place":"Singapore","title&qu= ot;:"Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology","type":"book"},"uris":["h= ttp://www.mendeley.com/documents/?uuid=3D382c71a8-35cb-4cd8-9ba7-266367081f= a3"]}],"mendeley":{"formattedCitation":"(Dey, 2018)","plainTextFormattedCitation":"(Dey, 2018)","previouslyFormattedCitation":"(30)"},"= ;properties":{"noteIndex":0},"schema":"https:= //github.com/citation-style-language/schema/raw/master/csl-citation.json&qu= ot;}(Dey, 2018). La exposición exces= iva puede ocasionar un endurecimiento de los tejidos (Atkins et al., 2004), Sería deseable que en el proceso se individualicen los especímenes de acuer= do con su volumen y características para evitar los efectos indeseables que ocasiona una exposición prolongada a los alcoholes (Dey, 2018).
Agentes deshidrantes, el etanol es el agente deshidrante más utilizado en los laboratorios de patología por ser un agente de rápido y eficaz efecto. Se recomienda la individualización de las concentraciones ascendentes del deshidratante , ya que tejidos delicados pueden necesitar concentraciones inicia= les de 30% (Dey, 2018).
Existen otros tipos de agentes deshidratantes en el mercado tales como el Metanol, Dioxane , Etilen Glycol o el Alcoho= l isopropil que pueden ser utilizados pero debido a sus desventajas comparadas con el Etanol , como el alto costo , rápida evaporac= ión o alto riesgo para el personal de laboratorio han pasado a segundo plano (Dey, 2018).
Aclaramient, el objetivo de = este proceso es la sustitución de la sustancia deshidratante por una sustancia miscible en el cual se pueda disolver el medio de inclusión (Montuenga & Calvo, 2014). Todos los agentes aclarantes tienen un índice de refracción que le permite = dar al tejido, desprovisto de agua una apariencia clara, la apariencia opaca en la visualización del tejido se traduce como un proceso de deshidratación incompleto (Dey, 2018).
Existen ciertas variables que pueden alterar el ef= ecto adecuado del aclarante, como son tejidos grandes, tipo de procesador que se utiliza, tiemp= os de deshidratación inadecuados o temperatura subóptima entre otros (Dey, 2018).
Uno de los aclarantes más utilizados es el Xileno,= el cual es un agente rápido, requiere alrededor de una hora por cada 5 mm para completar el proceso sin endurecer= en exceso los tejidos, lastimosamente es altamente toxico y controlado = (Dey, 2018; Montuenga & Calvo, 2014). Debido a esto existe en la actuali= dad un uso creciente de los sustitutos del Xileno en la fase de aclaramiento entre= los cuales tenemos a Neo-Celar de la empresa Alemana Merck , Otitix plus de origen italiano , Master clear de Maste= r Tech, entre las más utilizadas que han demostrado encontrarse a la par con el Xileno en las prestaciones de su uso histotecnológico (Moya-Salazar & Rojas-Zumaran, 2018).

Inclusión, s<= span lang=3DES-EC style=3D'font-size:12.0pt;line-height:115%;font-family:"Times = New Roman",serif'>u objetivo principal es el de rellenar los espacios dejados por el agua, es necesario eliminar completamente la sustancia aclarante, para darle a la pi= eza una estructura homogénea y dureza óptima para realizar buenos cortes (Lester, 2014; Montuenga & Calvo, 2014; Sy & Lee-Cyn, 2019).

El medio de impregnación ideal es aquel que sea miscible con el agente aclarante, de consistencia estable y homogénea a los cambios de temperatura, transparente para una adecuada valoración, barato y= no toxico durante la manipulación (Dey, 2018).
Existen varias sustancias utilizadas para este pro= ceso. En la actualidad la parafina es la más utilizada, es mezclada con polímeros plásticos que mejoran las características de la misma (Montuenga & Calvo, 2014). El proceso de inclusión se realiza mediante varios bańos en parafina fundid= a a temperaturas entre 40 y 70 grados centígrados, es importante el cambio constante para evitar la disminución de la efectividad y pérdida de las car= acterísticas (Montuenga & Calvo, 2014; Sadeghipour & Babaheidarian, 2019).

Se ha establecido un tiempo de entre 3 a 4 horas en parafina para lograr un efecto de impregnación optimo en el tejido en estud= io (Dey, 2018).
Técnica de inmunohistoquímica, la aparición, desarrol= lo y perfeccionamiento de la técnica de inmunohistoquímica, desde sus primeros p= asos en la década de los cuarenta del siglo pasado por Coon= s y colaboradores con el uso de fluorescencia en anticuerpos , la caracteriza= ción de la estructura molecular de los anticuerpos por los ganadores del premio nobel Porter y Edelman , hasta el desarrollo y producción de anticuerpos monoclonales por el también ganador del premio nobel en Medicina, Cesar Milstein en 1984, han contribuido = como uno de los hitos más notables en la historia de la Medicina. La inmunohistoquímica se ha convertido en la piedra angular junto al estudio morfológico en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de diversas entidad= es patológicas (Buys & Hidalgo, 2007; Grillo et al., 2017).

En la actualidad se ha difundido, popularizado y e= standarizado en los laboratorios de patología de todo el mundo y su uso se ha vuelto rutinario. Dada su importancia en el diagnóstico el anatomo patólogo está e= n la obligación de conocer su procedimiento y los múltiples factores que pueden alterar su correcta expresión (Bogen, 2020).
Inmunohistoquímica y el proceso pre analítico, el éxito de un buen resultado en la técnica de inmunohistoquímica, radica en el cuidado de los diferentes pasos en el proceso pre analítico. En esta revisión bibliográfic= a se analizarán los efectos que provoca en esta técnica el tiempo sin fijación, = el tiempo de fijación y el pH del fijador.

Tiempo previo sin fijación, como se había expuesto anteriormente uno de los principales obstáculos para una correcta valoració= n es el tiempo de isquemia sobre todo de isquemia fría que afecta la preservación del ARNm, acelera la activación de enzimas que degradan tejidos y por consi= guiente la perdida en la expresividad de los marcadores inmunohistoquímicos (Bass et al, 2014; Buffart et al., 2021). La literatura aconseja un tiempo máximo de una hora sin fijar para una corr= ecta conservación estructural y expresión de inmuno marcadores (Tresserra et al., 2016; Kanai et al., 2018; Ascierto et al., 2019).

Se ha determinado que los cambios moleculares apar= ecen desde 15 minutos después de la resección del tejido, la respuesta a la isquemia por la activación de cascadas de fosforilación y desfosforilación de diferentes pro= teínas desencadenan la perdida de fosfoepítopos necesa= rios para la reacción antígeno anticuerpo (Neumeister & Juhl, 2018). No siempre esto es una constante y= está determinada por factores como el tipo de tejido de estudio y las condiciones específicas de cada paciente (Khan et al., 2016). Esto explicaría la resistencia de ciertos marcadores a los procesos isquémi= cos (Neumeister & Juhl, 2018), como son los utilizados en cáncer de mama : KI67 Progesterona, Estrógenos y HER2 que no = se ven afectados por la isquemia sin fijación durante la primera= hora (Neumeister & Juhl, 2018).

Tiempo de Fijación, en la mayoría de las g= uías y protocolos de laboratorio se ha establecido un tiempo de fijación en un r= ango de 6 a 48 horas (Tresserra et al., 2016; Engel & Moore, 2011). Se ha demostrado que tiempos cortos de fijación alteran la reacción antígeno anticuerpo debido a que, en la fase de deshidratación del proceso, se genera una fijación alcohólica por un mecanismo de coagulación (Tresserra et al., 2016; Werner et al., 2000). Tiempos prolongados de fijación generan perdida de los puntos antigénicos debido a las características químicas del fijador (Tresserra et al., 2016; Engel & Moore, 2011). Estos puntos antigénicos disminuyen a los 8 días y se pierden en su totalid= ad a los 16 días de fijación ADDIN CSL_CITAT= ION {"citationItems":[{"id":"ITEM-1","itemDa= ta":{"author":[{"dropping-particle":"",&= quot;family":"Tresserra","given":"Francesc&qu= ot;,"non-dropping-particle":"","parse-names":= false,"suffix":""},{"dropping-particle":"= ;","family":"Angeles","given":"Mari= a","non-dropping-particle":"","parse-names&qu= ot;:false,"suffix":""},{"dropping-particle":&= quot;","family":"Lanao","given":"Ma= rtinez","non-dropping-particle":"","parse-nam= es":false,"suffix":""},{"dropping-particle&qu= ot;:"","family":"Soler","given":&qu= ot;M Teresa","non-dropping-particle":"","parse-nam= es":false,"suffix":""}],"container-title"= ;:"Revista de Senología y Patología Mamaria","id":"ITEM-1",&q= uot;issue":"1","issued":{"date-parts":[[= "2016"]]},"page":"26-31","title":&q= uot;Manejo de las muestras para test inmunohistoquímicos , moleculares y genéticos en = el cáncer de mama","type":"article-journal","volume":= "29"},"uris":["http://www.mendeley.com/documents/?= uuid=3D97517d67-4a9a-4759-b0ea-b705c8892088"]}],"mendeley":{= "formattedCitation":"(Tresserra et al., 2016)","plainTextFormattedCitation":"(Tresserra= et al., 2016)","previouslyFormattedCitation":"(49)"},"= ;properties":{"noteIndex":0},"schema":"https:= //github.com/citation-style-language/schema/raw/master/csl-citation.json&qu= ot;}(Tresserra et al., 2016).

Para muestras grandes son aceptados tiempos de fijación mínimo de 24 a 48 horas con un máximo de 72 horas .En muestras pequeńas el tiempo para lograr = una fijación óptima es mínimo de 6 hor= as pero en ningún caso superar las 72 horas (Dey, 2018; Tresserra et al., 2016).

PH del Fijador, s= e ha establecido que el medio de fijación influye drásticamente sobre la expresividad de los marcadores de inmunohistoquímica ya que generan enmascaramiento de los puntos antigénicos, este efecto se ve influenciado p= or el pH del fijador (Neumeister & Juhl, 2018; Tresserra et al., 2016).

No existe un consenso sobre un pH adecuado que modifique las propiedad= es de los tejidos , algunos autores recomiendan mantener pH neutro (Bass et al., 2014), otros sostienen que pH en rangos entre ácido y neutro ( pH 5 a 7) mantienen de mejor = manera los puntos antigénicos del tejido en estudio (True, 2014; Engel & Moore, 2011).

Pollard y Lunny (1987), realizaron un estudio del efecto de la fijación en la expresividad de inmunomarcadores de Linfocitos T, compararon fijadore= s bufferados con pH neutro (pH 7,5) versus fijadores no= bufferados con pH ácidos (pH 4), demostraron que el pH acido enmascara los puntos antigénicos que se tradujeron en una inmunotinción débil en el tejido.
Por otra parte se ha encontrado beneficioso el uso= de pH alcalinos de los fijadores, logrando una recuperación antigénica en teji= dos con fijación excesiva con resultados adecuados para la valoración y sin artefactos de inmunotinción (Marsch et al., 2015).

Conclusiones

·&nb= sp;        La presente revisión = demuestra la importancia del proceso pre analítico en sus diferentes fases, y su efec= to para obtención de laminillas adecuadas para un correcto análisis. Una adecuada fijación es vital en la fas= e preanalítica. Muestras sin fijación superiores a 1 hora, muestras con fijación menor a 6 horas o superiores a 72 horas afectan de manera notable la expresividad de marcadores de inmunohistoquímica

·&nb= sp;        Rangos muy ácidos del fijador generan un efecto negativo con afectación notable en la inmunoexpresividad.

·&nb= sp;        El Colegio Americano = de Patólogos (CAP) establece en sus guías el manejo preanalítico para el procesamiento de muestras de tejido mamario, pero para el resto de los especímenes, no existen protocolos o guías estandarizadas sobre las distint= as variables y sus efectos en el proceso pre-analítico, lo que impide una detección oportuna de errores y la corrección de los mismos, generando retr= asos en el diagnóstico, pérdida de recursos económicos y material biológico.

·&nb= sp;        En nuestro país mucho= s de los procedimientos médicos de manejo, tratamiento y seguimiento de las patologías prevalentes están debidamente regulados por protocolos estableci= dos y dispuestos por la autoridad sanitaria. Lamentablemente no se cuenta con protoco= los propios para el manejo de las muestras histopatológicas por lo que es deseable que = las autoridades dispongan la elaboración de normas de manejo del material para estudio anatomo patológico, evitando de esta manera diagnósticos incorrecto= s, por mal uso de fijadores, tiempos inadecuados o mal transporte de los especímenes

·&nb= sp;        El conocimiento del proceso pre analítico no solo es una obligación del Anatomo Patólogo como l= íder del laboratorio sino también del Medico clínico, del cirujano y del persona= l de apoyo, por lo que se torna importante la socialización de protocolos de man= ejo de especímenes para lograr un correcto diagnóstico.

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