Study of the
thermotropic behavior of DPPC using the ESR technique using DTBN rotation
probe.
=
María
Fernanda Heredia Moyano. [1], =
Sandra
Fabiola Heredia Moyano. [2], Luis Miguel Santillán Quiroga. [3]
Recibido:
11-07-2019 / Revisado: 18-08-2019 /Aceptado: 06-09-2019/ Publicado: 04-10-2=
019
Electron Spin Resonance (ESR) is an experimental
technique for detecting and characterizing chemical system for unpaired
electrons. In presence of an external magnetic field, the magnetic moments =
on
different centers tend to align with the field and hence with each other,
whereas in the absence of a field, the unpaired electrons are aligned rando=
mly.
Electron magnetic resonance occurs when an electro=
magnetic
wave in the microwave region interacts with the sample immersed in a magnet=
ic
field, in quantum mechanics this effect is called Zeeman Effect, which is an
energy splitting between the two allowed spin state.
It is important to do a ESR study to prove and make
comparisons about what theory says of biologic components characteristics, =
in
this case a lipid molecule.
This study will be developed preparing a solution =
and
a lipid molecule, then they will be studied in the ESR spectrometer, one by
one, and together at different temperatures. Also, to verify the theoretic =
and
experimental data, the partition parametric will be used by measuring the
intensity of the spectra and using equations at diverse temperatures. The a=
nalyses
of the obtained data show that a change of conformation in the lipid molecu=
le
exists when the temperature is increased and the pre transition and main ph=
ase
are observed., the equations of maximum rainfall intensities proposed by the
INAMHI are used to obtain
Resumen.
La
técnica de espectroscopia Electron Spin Resonance (ESR) es una técnica experimental para dete=
ctar y
caracterizar sistemas químicos que poseen electrones impares. En presencia =
de
un campo magnético externo, el momento magnético en diferentes centros tien=
den
a alinearse con el campo y además con cada uno de ellos, así como en ausenc=
ia
del campo los electrones impares son alineados aleatoriamente.
La
resonancia magnética del electrón ocurre cuando una onda electromagnética e=
n la
región del microondas interactúa con la muestra inmersa en un campo magnéti=
co,
a este efecto se le llama efecto Zeeman en mecánica cuántica, que es un
movimiento energético split entre dos estados
permitidos.
Es
importante hacer un estudio de ESR para comprobar y hacer comparaciones de =
lo
que nos dice la teoría en cuanto a características de componentes biológicos
como en este caso de una molécula lipídica,
Este
estudio se realizará preparando una solución y una molécula lipídica y luego
serán estudiadas en el espectrómetro ESR por separado y juntas a diferentes
temperaturas. Además, para la verificación de los datos teóricos y
experimentales se utilizará un parámetro de partición mediante la medición =
de
intensidad del espectro y utilizando ecuaciones, a varias temperaturas. El
análisis de los datos obtenidos indica que existe un cambio de conformación=
de
la molécula lipídica al incrementar la temperatura y se observa la fase de =
pre
transición y la transición principal.
P=
alabras
claves: <=
span
lang=3DCA style=3D'font-size:12.0pt;line-height:115%;font-family:"Times New=
Roman",serif;
mso-ansi-language:CA'>ESR, DTBN, DPPC, Parámetro de partició=
n.
Intro=
ducción.
Las membranas lipídicas
pueden ser estudiadas a través de la técnica Electron<=
/span>
Spin Resonance ESR, que es una técnica espectro=
scópica
ampliamente usada para determinar el análisis de especies paramagnéticas que
contienen al menos un electrón impar.
Existen en la naturaleza
sustancias paramagnéticas estables que puede ser aplicadas con la técnica E=
SR a
especies biológicas que no contienen especies radicales, se las puede inser=
ir
centros paramagnéticos utilizando un spin label=
como
prueba (Chiesa, M., Giamello, E., pp1-3).
La espectroscopia Electron Spin Resonance ha
encontrado constantemente aplicaciones en la problemática de la bioquímica y
biomedicina, como un medio potente y sensible para la revelación de especies
con radicales. De modo que se aplica tanto a la identificación de radicales
intermedios en reacciones metabólicas y cuanto, a observaciones de especies
paramagnéticas estables presentes en la naturaleza, o al levantamiento de
radicales producidos por radiaciones externas y también en el análisis de
sondas paramagnéticas introducidas en sistemas biológicos específicos (spin=
labeling).
Este fenómeno se lo cono=
ce
con diversos nombres, pero son equivalentes, que tienen la finalidad de
enfatizar aspectos diferentes del mismo fenómeno, entre los más comunes est=
án
“Resonancia Paramagnética Electrónica” (EPR) ó
Resonancia Electrónica de Spin (ESR).
El objetivo de este anál=
isis
es estudiar el comportamiento termotrópico de u=
na
bicapa de DPPC (dipalmitoilfosfatidilcolina) me=
diante
espectroscopía ESR, en presencia de un spin probe
DTBN (diterbutilnitroxide), identificando las
temperaturas de pre transición (Tp) y de transi=
ción
principal de fase (Tm).
Metodologia.
ESR
Esta técnica utiliza =
la
propiedad intrínseca del electrón, es decir su propio spin s, que hace que =
el
electrón pueda asociarse con un momento dipolar magnético µ, definido como =
En ausencia de un cam=
po
magnético H, los espines presentes en la muestra se orientan en forma aleat=
oria
en el mismo estado energético, si se introduce un campo magnético uniforme =
con
una orientación definida
La
energía de interacción entre µ y H está definida por la Hamiltoniana de Zee=
man
Entonces
en un sistema con
Figura
Fuen=
te: Elaboración Propia
Comportamiento
termotrópico
Los liposomas son vesículas fosfolipídicas con un diámetro variable entre 5 nm y 1 µm, y están normalmente constituidas por u= na doble capa de fosfolípidos entre otros componentes como puede ser también el colesterol.
Al aumentar la temperatura a las moléculas lipídicas, estas sufren un cambio conformacional o una transición de fase al absorber el calor, se puede estu= diar el cambio de un estado GEL (estado ordenado) a un estado FLUIDO (estado desordenado).
A
bajas temperaturas el DipalmitoilfosfatidilcolinaColin=
a
(DPPC) se encuentra en un estado ordenado, en fase GEL
Si
se aumenta la temperatura en alrededor de los 32º C y la bicapa conserva su
fase GEL, pero presenta una ondulación en la superficie, la cual toma el no=
mbre
de fase RIPPLE
Aumentando
aún más la temperatura alrededor de los 41º C se llega al estado líquido
cristalino, es decir la fase fluida, desordenada
Coeficiente
de Partición
Para
valorar la concentración de prueba en la región hidrofóbica del DPPC usamos=
el
coeficiente de partición
Preparación
de la muestra
Se
preparó una solución de Diterbutilnitroxilo DTB=
N 10-3M
y 5x10-4 M en agua destilada. La concentración de DTBN 5x10=
-4 M
se centrifuga y se la mide en el espectrómetro ESR a una potencia de 10mW, =
con
una frecuencia de modulación del campo de 100kHz y una amplitud de modulaci=
ón
de 025 Gauss. Se realizaron medidas del espectro de resonancia del campo a
temperaturas de 25°C, 35°C y 50°C.
Se preparó la muestra=
de
DPPC, disolviendo 7.35 mg de polvo del DPPC en cloroformo y se la evaporó b=
ajo
un flujo de nitrógeno gaseoso, se obtuvo finalmente una película lipídica al
cual se deja reposar en el vacío por 24 horas. Se hidrata la película de DP=
PC
con la solución de DTBN 5x10-4 M en agua destilada a 50°C, se
insertó en un capilar para ser medido en el espectrómetro de ESR.
Las medidas del espec=
tro
del DTBN en la miscela de DPPC en agua se midie=
ron a
las temperaturas de 25°C, 27°C, 30°C, 32°C, 35°C, 37°C, 39°C, 41°C, 43°C, 4=
5°C
e 50°C.
Resultados
En
la Figura 2 se muestra la sobre posición del espectro del DTBN en tres
diferentes temperaturas 25°C, 35°C y 50°C y podemos ver que, variando la
temperatura, la intensidad del espectro no cambia.
Figura 2. DTB en tres diferentes
temperaturas en función del campo magnético
Fuente: Elaboración propia.
=
El DTBN en DPPC en solución acuosa a temperatura 25°C y 50°C en la fa= se GEL y la fase LIQUIDO CRISTALINA se puede observar en la Figura 3 la sobre posición de los espectros para evidenciar las variaciones
Figura =
2. DPPC/DTBN a 25 ºC en negro y línea cortad=
a y el
DPPC/DTBN a 50 ºC en rojo y línea continua.
Fuente: Elaboración propia.
Sobreponiendo
finalmente los espectros del DTBN en DPPC a la temperatura de pre-transición Tp
de 35 °C y a la temperatura de la transición principal Tm =
de
41°C como podemos ver en la Figura 4, en donde verificamos la variación en =
la
intensidad del espectro que disminuye una vez que el DTBN interacciona con =
el
DPPC.
Figura
Fuente: Elaboración propia.
A
través de los espectros de la muestra de DTBN en DPPC registrados a varias
temperaturas, se puede medir la altura hl y hw,
para poder calcular el parámetro de partición P y el parámetro corregido Pc=
*,
los cuales podemos ver en la Tabla 1.
Tabla 1. Valores de HL, HW, Pc y Pc*=
en
varias temperaturas.
|
Temperatura °C |
HL |
HW |
Pc |
Pc* |
|
25 |
195,25 |
4753,836 |
0,03945 |
0,13099 |
|
27 |
230,213 |
4574,626 |
0,04791 |
0,1559 |
|
30 |
212,457 |
4178,573 |
0,04838 |
0,15726 |
|
32 |
239,782 |
4189,714 |
0,05413 |
0,17358 |
|
35 |
305,134 |
3535,575 |
0,07944 |
0,24055 |
|
37 |
338,856 |
3245,185 |
0,09454 |
0,27705 |
|
39 |
336,9761 |
3135,14 |
0,09705 |
0,28288 |
|
41 |
756,497 |
2205,29 |
0,25767 |
0,55732 |
|
43 |
723,706 |
2080,664 |
0,25806 |
0,57562 |
|
45 |
714,094 |
2002,535 |
0,26286 |
0,57937 |
|
50 |
678,084 |
1740,176 |
0,28041 |
0,58489 |
Los
valores de Pc* nos ayuda a estudiar el cambio en función de la temperatura,=
en
la Figura 5, y se hace una comparación entre la curva experimental con la
distribución de Pc* teóricos.
SEQ Figura \* ARABIC 4. Coeficiente de partición
corregido Pc* en función de la temperatura.
Fuente: Elaboración propia.
Conclusiones.
· =
Se
puede hacer el estudio del cambio de transición de fase de moléculas biológ=
icas
a través de técnicas de espectrometría, como en este caso se usó el Electron Spin Resonance E=
SR.
· =
Se
comprueba lo que nos dice la teoría que, al cambiar de temperatura a una
membrana lipídica, esta pasa de un estado ordenado a un estado desordenado,
habiendo así un cambio de fase.
· =
Se
verifica el cambio del espectro en la mitad cuando el DTBN interacción con =
el
DPPC, lo cual quiere decir que la bicapa permite el ingreso del DTBN al
aumentar la temperatura.
· =
De
la comparación de la curva teórica y experimental del Pc* en función de la
temperatura se puede notar que hay una similitud en la zona principal de
transición.
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PARA
CITAR EL ARTÍCULO INDEXADO.
Heredia Moyano, M., Heredia Moyano, S., & Santillán Quiroga, L. (2019). Estudio del comportamiento termotrópico del DPPC mediante la técnica ESR utilizando spin probe DTBN. Cien= cia Digital, 3(4), 34-43. https://doi.org/1= 0.33262/cienciadigital.v3i4.920
El artículo que se publica es de
exclusiva responsabilidad de los autores y no necesariamente reflejan el
pensamiento de la Revista Ciencia
Digital.
El artículo qu=
eda
en propiedad de la revista y, por tanto, su publicación parcial y/o total en
otro medio tiene que ser autorizado por el director de la Revista Ciencia Digital.
[1] Escuela Superior Politécnica=
de
Chimborazo, Facultad de Ciencias, =
Riobamba,
Ecuador, mariaf.heredia@espoch.edu.ec
[2] Universidad de la Calabria,
Departamento de Química, Rende, Italia,
herediafhm@gmail.com
[3]
Escuela Superior Politécnica=
de
Chimborazo, Facultad de Ciencias, Riobamba, Ecuador,
luis.sa=
ntillanquiroga@espoch.edu.ec
www.cienciadigital.org
=
Vol. 3, N°4, p. 34-43,octubre - diciembre, 20